La viabilidad del trabajo con material biológico en estos potentes microscopios ha abierto un importante frente de investigación y el grupo dirigido por José L. Carrascosa en el Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), en España, se propuso hace tres años dar un paso más allá. Su objetivo era descubrir si, además de detectarlos, era posible observar las fases de maduración de los virus dentro de la célula. “Hemos conseguido hacerlo a nivel de células completas, sin utilizar ningún tipo de agente de marcaje o fluorescencia y con un daño inducido por radiación prácticamente invisible”, explica el investigador.
Para ello, el equipo del CNB ha trabajado con células congeladas y el virus Vaccinia, correlacionando tres métodos de visualización: la microscopía óptica, la electrónica y la nueva criomicrotomografía de rayos X. Su objetivo era dejar patente las ventajas de esta última técnica, que incorpora mejoras de las ópticas de rayos X, opera a bajísimas temperaturas, y ofrece imágenes tridimensionales mediante reconstrucción tomográfica. “Hemos comprobado que se pueden ver, y muy bien, sus distintas formas de maduración”, asegura Carrascosa.
Sus resultados demuestran que es posible observar la estructura celular en un rango intermedio entre el dominio de la microscopia óptica, que tiene menos resolución que la de rayos X, y el de la microscopia electrónica, que tiene una resolución mayor que esta pero una penetración muy limitada. Esto permite por primera vez a los investigadores ‘hacer zum’ desde la célula entera hasta la estructura de los complejos inte os que la constituyen. “Podemos ver la película completa de la célula”, ilustra Carrascosa.
Tal y como explica el investigador, la estrategia de correlacionar los tres métodos de observación les sirvió para garantizar que lo que estaban viendo “era genuino” y extender al nivel de las células completas lo que ya hacían con fragmentos de células usando microscopía electrónica. "Esto nos ofrece por primera vez la posibilidad de analizar de forma cuantitativa aspectos estructurales de las células”, afirma Carrascosa, que añade que gracias a esta cuantificación podrían correlacionar la presencia o ausencia de determinados factores dentro de las células con ciertas enfermedades, por ejemplo, dentro de células cancerosas.
La clave para que la criomicrotomografía de rayos X sea viable radica en que los investigadores ‘miran’ en un determinado rango de energía llamado water window donde la forma en que se ve el material biológico es óptima y no son necesarios agentes de tinción o fosforescencia. “Se aprovecha un contraste intrínseco que tiene el material cuando se observa en ese rango de los rayos X”, explica Carrascosa. “Es una casualidad afortunada, pero a la vez es una de las bazas fuertes por las que esta microscopía es factible”.
En opinión de Martin de Jonge, investigador sénior de Microscopía de Fluorescencia de Rayos X en el Sincrotrón Australiano, esta habilidad de ver estructuras relevantes en células enteras y sin utilizar tinción es el aspecto más prometedor del trabajo de Carrascosa. “La microscopía de rayos X que utiliza radiaciones de baja energía y tomografía se está convirtiendo en una herramienta fundamental con la que investigar las funciones por debajo del nivel celular”, asegura.
nAunque el equipo de Carrascosa ha usado las otras técnicas solo como herramienta metodológica para verificar su nuevo enfoque, la combinación de varias de ellas no debe descartarse como planteamiento útil en biología estructural, de hecho, generalmente es el más indicado. Carrascosa prevé que la correlación ente microscopía óptica, electrónica y esta nueva tecnología se mantenga “de forma permanente” en la mayor parte de los problemas que se estudien con ella.
Por ejemplo, su combinación con los microscopios ópticos permite seleccionar las células más adecuadas para su posterior estudio en profundidad con la microscopía de rayos X, tal y como hicieron los investigadores. “El tiempo en los sincrotrones es oro, debíamos saber qué células mirar y eliminar de la observación las que no estaban infectadas”, explica Carrascosa. Esta selección previa se realiza marcando el virus con fluorescencia y eligiendo posteriormente sólo las células que al ser vistas por el microscopio óptico presenten dicha fluorescencia. Además de suponer un ahorro de tiempo y esfuerzo, esto asegura al investigador que los resultados que obtiene son los correctos. “El artículo desarrolla correlativamente la microscopía de rayos X de baja energía y la de fluorescencia óptica, demostrando claramente los beneficios de esa combinación”, considera De Jonge.
Otra alte ativa consiste en aprovechar la gran sensibilidad que ofrece otro sistema, la fluorescencia de rayos X, para detectar y localizar cantidades pequeñas de iones metálicos en el interior de las células. “Las dos técnicas son también complementarias y resultan óptimas para investigar determinadas cuestiones”, explica De Jonge, experto en este campo que utiliza radiaciones más energéticas y que resulta de gran ayuda en medicina para estudiar las causas de diversas enfermedades metabólicas.
La criomicrotomografía de rayos X completa el abanico de posibilidades a la hora de estudiar de manera continua desde el nivel molecular hasta las células enteras. Además, abre todo un campo de posibilidades en el ámbito de la biología estructural, lo que ha motivado que la revista científica Jou al of Structural Biology le acabe de dedicar un número especial que ha sido editado por el propio Carrascosa y por el profesor del la Universidad de Califo ia en Berkeley (Estados Unidos), Robert M. Glaeser.
Sin embargo, aún existen ciertas limitaciones que restringen su desarrollo. Entre ellas está la dificultad para acceder a los sincrotrones, las instalaciones donde se encuentran los microscopios de rayos X que los investigadores necesitan para mirar sus muestras. “Actualmente existen solo 3 o 4 en todo el mundo, y el acceso a ellos es muy restringido”, explica Carrascosa, cuyo equipo trabajó en el sincrotrón de Berlín.
Para conseguir que las utilidades de los sincrotrones lleguen a mayor número de científicos, algunas empresas están desarrollando lo que se conoce como laboratory-source-based-microscopes, equipos comerciales con los que hacer microscopía de rayos X que pueden encontrarse en un laboratorio convencional a un coste menor. “Nunca serán tan potentes como los sincrotrones pero facilitarán mucho las cosas”, asegura Carrascosa.
Para De Jonge, además de la dificultad de acceso a los sincrotrones, existen otros dos grandes retos en el horizonte de la esta técnica: el procesamiento de las grandes cantidades de datos que se generan y la limitación en el grosor de las muestras que pueden observarse. “Los conjuntos de datos pueden tomarse en 10 minutos pero requieren días para ser analizados y comprendidos”, afirma.
Respecto a la reducida profundidad de campo que viene determinada por la alta resolución de este método, el experto considera que, mediante una serie de procedimientos matemáticos, podría desarrollarse un sistema en el que el espécimen a observar “no tenga que encontrarse por completo dentro de la profundidad de campo”. De Jonge considera que esto “será trabajoso” pero “permitirá analizar muchas más clases de células”.
Por su parte, Carrascosa se muestra de acuerdo en este último desafío: “Hay que seguir trabajando en métodos que sean capaces de preparar el mayor número de muestras en las mejores condiciones para que sean susceptibles de análisis por este nuevo tipo de metodología”, concluye el investigador.